Амф как вторичный мессенджер
Гормоны. Гидрофильные гормоны
Вторичные мессенджеры, или посредники, это внутриклеточные вещества, концентрация которых строго контролируется гормонами, нейромедиаторами и другими внеклеточными сигналами (см. с. 372). Такие вещества образуются из доступных субстратов и имеют короткий биохимический полупериод. Наиболее важными вторичными мессенджерами являются цАМФ (сAMP), цГТФ (cGTP), Са 2+ , инозит-1,4,5-трифосфат [ИФ 3 (lnsP 3 )], диацилглицерин [ДАГ (DAG)] и монооксид азота (NO).
А. Циклический АМФ
Биосинтез. Нуклеотид цАМФ (3′,5′-циклоаденозинмонофосфат, сАМР> синтезируется мембранными аденилатциклазами [ 1 ] — семейством ферментов, катализирующих реакцию циклизации АТФ (АТР) с образованием цАМФ и неорганического пирофосфата. Расщепление цАМФ с образованием АМФ (AMP) катализируется фосфодиэстеразами [ 2 ], которые ингибируются при высоких концентрациях метилированных производных ксантина, например кофеином.
Активность аденилатциклазы контролируется G-белками, которые в свою очередь сопряжены с рецепторами третьего типа , управляемыми внешними сигналами (см. с. 372). Большинство G-белков (G s -белки) активируют аденилатциклазу, некоторые G-белки ее ингибируют (G i -белки). Некоторые аденилатциклазы активируются комплексом Са 2+ /кальмодулин.
Механизм действия. цАМФ является аллостерическим эффектором протеинкиназ А (ПК-Α) [ 3 ] и ионных каналов (см. с. 372). В неактивном состоянии ПК-Α является тетрамером, две каталитические субъединицы (К-субъединицы) которого ингибированы регуляторными субъединицами (Р-субъединицы) (аутоингибирование). При связывании цАМФ Р-субъединицы диссоциируют из комплекса и К-единицы активируются. Фермент может фосфорилировать определенные остатки серина и треонина в более чем 100 различных белках, в том числе во многих ферментах (см. с. 158) и факторах транскрипции. В результате фосфорилирования изменяется функциональная активность этих белков.
Наряду с цАМФ функции вторичного мессенджера может выполнять и цГМФ (cGMP) (см. с. 346). Оба соединения различаются по метаболизму и механизму действия.
Б. Роль ионов кальция
Уровень ионов кальция. Концентрация ионов Са 2+ в цитоплазме нестимулированной клетки очень низка (10-100 нМ). Низкий уровень поддерживается кальциевыми АТФ-азами (кальциевыми насосами) и натрий-кальциевыми обменниками. Резкое повышение концентрации ионов Са 2+ в цитоплазме (до 500-1000 нМ) происходит в результате открывания кальциевых каналов плазматической мембраны или внутриклеточных кальциевых депо (гладкого и шероховатого эндоплазматического ретикулума). Открывание каналов может быть вызвано деполяризацией мембран или действием сигнальных веществ, нейромедиаторов (глутамат и АТФ, см. с. 342), вторичных мессенджеров ( ИФ 3 и цАМФ ), а также вещества растительного происхождения рианодина. В цитоплазме и клеточных органеллах имеется множество белков способных связывать Са 2+ , некоторые из них выполняют роль буфера.
При высокой концентрации в цитоплазме ионы Са 2+ оказывает на клетку цитотоксическое действие. Поэтому уровень кальция в отдельной клетке испытывает кратковременные всплески, увеличиваясь в 5-10 раз, а стимуляция клетки увеличивает лишь частоту этих флуктуаций.
Действие кальция опосредовано специальными Са 2+ -связывающими белками ( «кальциевыми сенсорами» ), к которым принадлежат аннексин, кальмодулин и тропонин (см. с. 326). Кальмодулин — сравнительно небольшой белок (17 кДа) — присутствует во всех животных клетках. При связывании четырех ионов Са 2+ (на схеме голубые кружочки) кальмодулин переходит в активную форму, способную взаимодействовать с многочисленными белками. За счет активации кальмодулина ионы Са 2+ оказывают влияние на активность ферментов, ионных насосов и компонентов цитоскелета.
B. Инозит-1,4,5-трифосфат и диацилглицерин
Гидролиз фосфатидилинозит-4,5-дифосфата [ФИФ 2 (PlnsP 2 )] фосфолипазой С [ 4 ] приводит к образованию двух вторичных мессенджеров: инозит-1,4,5-трифосфата и диацилглицерина. Гидрофильный ИФ 3 поступает в эндоплазматический ретикулум [ЭР (ЕR)] и индуцирует высвобождение ионов Са 2+ из запасающих везикул. Липофильный ДАГ остается в мембране и активирует протеинкиназу C , которая в присутствии Са 2+ фосфорилирует различные белковые субстраты, модулируя их функциональную активность.
Спр. материал / ГОРМОНЫ2 / Аденилатциклазная мессенджерная система
Аденилатциклазная мессенджерная система
В механизме действия ряда гидрофильных гормонов ключевую роль играет вторичный посредник (мессенджер) — циклический АМФ (цАМФ), образующийся из АТФ при участии фермента адени-латциклазы. Различные гормоны увеличивают либо снижают внутриклеточный уровень цАМФ. Например, адреналин резко увеличивает концентрацию цАМФ в мышцах, но относительно мало влияет на печень. Противоположное влияние оказывает глюкагон. Ответ тканей на действие гормонов этой группы осуществляется через уникальные для каждого гормона рецепторы, сопряженные с одним и тем же ферментом — аденилатциклазой. Так, в клетках жировой ткани адреналин, АКТГ, глюкагон, вазопрессин, МСГ стимулируют аденилатцикла-зу и повышают уровень цАМФ. Аденилатциклазная система включает несколько компонентов (рис. 4.6).
При связывании гормона с рецептором коиформация последнего изменяется так, что гормон-рецепторный комплекс связывается с ГТФ-зависимым белком (G-белком) внутри мембраны. Происходит активация G-белка, и он оказывает влияние на аденилатциклазу (актив»рует или ингибирует).
Активная аденилатциклаза, локализованная на внутренней поверхности плазматической мембраны, катализирует образование цАМФ из АТФ в присутствии ионов Mg2+. Образующийся вторичный посредник (цАМФ) является аллостерическим эффектором фермента протеинкиназы, состоящего из четырех субъедиииц: двух регулятор-ных (2R) и двух каталитических (2С).
В ассоциированном состоянии протеинкиназа неактивна. Присоединяя четыре молекулы цАМФ, протеинкиназа диссоциирует на 2R- и 2С-субъедипицы, при этом открывается активный центр каталитической субъединицы. Фермент катализирует фосфорилироваиие ряда белков с образованием фосфопротеинов путем переноса фосфатной группы от АТФ (Mg2+) на остаток серина или треонина в различных белках (более 100 регуляторных белков, в том числе ферментов). В результате фосфорилирования изменяется функциональная активность этих белков (см. рис. 4.6).
Протеинкиназы, зависимые от инсулина и эпидермалыюго фактора роста (ЭФР), уникальны тем, что их ферментативная активность локализована в рецепторе гормона и проявляется при связывании гормона-лиганда с рецептором. Они фосфорилируют преимущественно остатки тирозина.
Протеинкиназы были обнаружены в различных клеточных структурах: клеточной мембране, цитоплазме, рибосомах, ядерной мембране, хроматине. Они могут быть зависимыми от цАМФ или цГМФ, а также от других вторичных посредников.
Действие гормонов, опосредованное увеличением концентрации цАМФ, может быть прекращено путем гидролиза цАМФ фосфоди-эстеразами (см. рис. 4.6). Фосфодиэстеразы циклического АМФ существуют в двух формах (с высокой и низкой Кт) и сами служат объектом регуляции со стороны гормонов, а также внутриклеточных посредников, таких как Са2+-кальмодулиповый комплекс. Ингибиторы фосфодиэстеразы (например, кофеин) увеличивают внутриклеточный уровень цАМФ, тем самым усиливая действие гормонов.
Еще один способ контроля гормонального эффекта — регуляция процесса дефосфорилирования белков под действием фосфопротеин-фосфатаз.
В целом эффект влияния цАМФ на белки обусловлен процессами фосфорилирования — дефосфорилирования белков (ковалентная модификация). Любое воздействие цАМФ, в том числе на такие разные процессы, как метаболизм углеводов и жиров, транспорт ионов, индукция ферментов, рост и деление клеток, может регулироваться активностью специфической протеинкиназы или специфической фосфатазы.
Например, регуляция метаболизма гликогена осуществляется путем изменения активности гликогенсинтазы (неактивна в фосфорилиро-ванной форме, активна в дефосфорилировашюй) и фосфорилазы (неактивна в дефосфорилировашюй форме, активна в фосфорилирован-ной). Повышение концентрации цАМФ приводит к активации фосфорилазы и одновременно к переходу гликогенсиптазы в неактивную форму. Таким образом, при ипгибироваиии гликогенеза усиливается гликогенолиз, а при ипгибировании гликогенолиза — глико-генез
Вторичные посредники (мессенджеры)
Мессенджеры – низкомолекулярные вещества, переносящие сигналы гормонов внутри клетки. Они обладают высокой скоростью перемещения, расщепления или удаления (Са 2+ , цАМФ, цГМФ, ДАГ, ИТФ).
Нарушения обмена мессенджеров приводят к тяжелым последствиям. Например, форболовые эфиры, которые являются аналогами ДАГ, но в отличие от которого в организме не расщепляются, способствуют развитию злокачественных опухолей.
цАМФ открыта Сазерлендом в 50 годах прошлого века. За это открытие он получил Нобелевскую премию. цАМФ участвует в мобилизации энергетических запасов (распад углеводов в печени или триглицеридов в жировых клетках), в задержке воды почками, в нормализации кальциевого обмена, в увеличении силы и частоты сердечных сокращений, в образовании стероидных гормонов, в расслаблении гладких мышц и так далее.
цГМФ активирует ПК G, ФДЭ, Са 2+ -АТФазы, закрывает Са 2+ -каналы и снижает уровень Са 2+ в цитоплазме.
Ферменты
Ферменты каскадных систем катализируют:
образование вторичных посредников гормонального сигнала;
активацию и ингибирование других ферментов;
превращение субстратов в продукты;
Гликопротеин с массой от 120 до 150 кДа, имеет 8 изоформ, ключевой фермент аденилатциклазной системы, с Mg 2+ катализирует образование вторичного посредника цАМФ из АТФ.
АЦ содержит 2 –SH группы, одна для взаимодействия с G-белком, другая для катализа. АЦ содержит несколько аллостерических центров: для Mg 2+ , Mn 2+ , Ca 2+ , аденозина и форсколина.
Есть во всех клетках, располагается на внутренней стороне клеточной мембраны. Активность АЦ контролируется: 1) внеклеточными регуляторами — гормонами, эйкозаноидами, биогенными аминами через G-белки; 2) внутриклеточным регулятором Са 2+ (4 Са 2+ -зависимые изоформы АЦ активируются Са 2+ ).
Протеинкиназа А (ПК А)
ПК А есть во всех клетках, катализируют реакцию фосфорилирования ОН- групп серина и треонина регуляторных белков и ферментов, участвует в аденилатциклазной системе, стимулируется цАМФ. ПК А состоит из 4 субъединиц: 2 регуляторных R (масса 38000 Да) и 2 каталитических С (масса 49000 Да). Регуляторные субъединицы имеют по 2 участка связывания цАМФ. Тетрамер не обладает каталитической активностью. Присоединение 4 цАМФ к 2 субъединицам R приводит к изменению их конформации и диссоциации тетрамера. При этом высвобождаются 2 активные каталитические субъединицы С, которые катализируют реакцию фосфорилирования регуляторных белков и ферментов, что изменяет их активность.
Протеинкиназа С (ПК С)
ПК С участвует в инозитолтрифосфатной системе, стимулируется Са 2+ , ДАГ и фосфатидилсерином. Имеет регуляторный и каталитический домен. ПК С катализирует реакцию фосфорилирования белков-ферментов.
Протеинкиназа G (ПК G) есть только в легких, мозжечке, гладких мышцах и тромбоцитах, участвует в гуанилатциклазной системе. ПК G содержит 2 субъединицы, стимулируется цГМФ, катализирует реакцию фосфорилирования белков-ферментов.
Гидролизует фосфоэфирную связь в фосфатидилинозитолах с образованием ДАГ и ИФ3, имеет 10 изоформ. ФЛ С регулируется через G-белки и активируется Са 2+ .
ФДЭ превращает цАМФ и цГМФ в АМФ и ГМФ, инактивируя аденилатциклазную и гуанилатциклазную систему. ФДЭ активируется Са 2+ , 4Са 2+ -кальмодулином, цГМФ.
NO-синтаза – это сложный фермент, представляющий собой димер, к каждой из субъединиц которого присоединено несколько кофакторов. NO-синтаза имеет изоформы.
Синтезировать и выделять NO способно большинство клеток организма человека и животных, однако наиболее изучены три клеточные популяции: эндотелий кровеносных сосудов, нейроны и макрофаги. По типу синтезирующей ткани NO-синтаза имеет 3 основные изоформы: нейрональную, макрофагальную и эндотелиальную (обозначаются соответственно как NO-синтаза I, II и III).
Нейрональная и эндотелиальная изоформы NO-синтазы постоянно присутствуют в клетках в небольших количествах, и синтезируют NO в физиологических концентрациях. Их активирует комплекс кальмодулин-4Са 2+ .
NO-синтаза II в макрофагах в норме отсутствует. При воздействии на макрофаги липополисахаридов микробного происхождения или цитокинов они синтезируют огромное количество NO-синтазы II (в 100-1000 раз больше чем NO-синтазы I и III), которая производит NO в токсических концентрациях. Глюкокортикоиды (гидрокортизон, кортизол), известные своей противовоспалительной активностью, ингибируют экспрессию NO-синтазы в клетках.
NO — низкомолекулярный газ, легко проникает через клеточные мембраны и компоненты межклеточного вещества, обладает высокой реакционной способностью, время его полураспада в среднем не более 5 с, расстояние возможной диффузии небольшое, в среднем 30 мкм.
В физиологических концентрациях NO оказывает мощное сосудорасширяющее действие:
Эндотелий постоянно продуцирует небольшие количества NO.
При различных воздействиях – механических (например, при усилении тока или пульсации крови), химических (липополисахариды бактерий, цитокины лимфоцитов и кровяных пластинок и т.д.) – синтез NO в эндотелиальных клетках значительно повышается.
NO из эндотелия диффундирует к соседним гладкомышечным клеткам стенки сосуда, активирует в них гуанилатциклазу, которая синтезирует через 5с цГМФ.
цГМФ приводит к снижению уровня ионов кальция в цитозоле клеток и ослаблению связи между миозином и актином, что и позволяет клеткам через 10 с расслабляться.
На этом принципе действует препарат нитроглицерин. При расщеплении нитроглицерина образуется NO, приводящий к расширению сосудов сердца и снимающий в результате этого чувство боли.
NO регулирует просвет мозговых сосудов. Активация нейронов какой-либо области мозга приводит к возбуждению нейронов, содержащих NO-синтазу, и/или астроцитов, в которых также может индуцироваться синтез NO, и выделяющийся из клеток газ приводит к локальному расширению сосудов в области возбуждения.
NO участвует в развитии септического шока, когда большое количество микроорганизмов, циркулирующих в крови, резко активируют синтез NO в эндотелии, что приводит к длительному и сильному расширению мелких кровеносных сосудов и как следствие – значительному снижению артериального давления, с трудом поддающемуся терапевтическому воздействию.
В физиологических концентрациях NO улучшает реологические свойства крови:
NO, образующийся в эндотелии, препятствует прилипанию лейкоцитов и кровяных пластинок к эндотелию и также снижает агрегацию последних.
NO может выступать в роли антиростового фактора, препятствующего пролиферации гладкомышечных клеток стенки сосудов, важного звена в патогенезе атеросклероза.
В больших концентрациях NO оказывает на клетки (бактериальные, раковые и т.д) цитостатическое и цитолитическое действие следующим образом:
при взаимодействии NO с радикальным супероксид анионом образуется пероксинитрит (ONOO-), который является сильным токсичным окислителем;
NO прочно связывается с геминовой группой железосодержащих ферментов и ингибирует их (ингибирование митохондриальных ферментов окислительного фосфорилирования блокирует синтез АТФ, ингибирование ферментов репликации ДНК способствуют накоплению в ДНК повреждений).
NO и пероксинитрит могут непосредственно повреждать ДНК, это приводит к активации защитных механизмов, в частности стимуляции фермента поли(АДФ-рибоза) синтетазы, что еще больше снижает уровень АТФ и может приводить к клеточной гибели (через апоптоз).